豆瓣生產(chǎn)污水中微生物降解氨氮

　　水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象已成為世界上重要的水環(huán)境污染問題，富營養(yǎng)化通常指在人類活動的影響下，生活污水、化肥和食品等工業(yè)廢水、降水以及地表徑流中含有的大量氮、磷及其他無機鹽等植物營養(yǎng)物質(zhì)輸入水庫、湖泊、河流等緩流水體后，引起藻類及其他浮游生物的迅速繁殖，水體溶解氧下降，水質(zhì)惡化，魚類及其他生物大量死亡的現(xiàn)象。隨著工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的迅速發(fā)展，人類每天向自然界中排放大量富含氮磷的工業(yè)廢水，這些廢水如不經(jīng)過處理排入水體中，就增加了水體中營養(yǎng)物質(zhì)的負荷量，導致水體富營養(yǎng)化

　　目前，我國許多食品企業(yè)存在規(guī)模小、技術(shù)落后、廢水排放量大等問題，而企業(yè)又無能力建設(shè)符合標準的環(huán)保處理裝置，其直接后果就是將廢水直接排放，污染江河湖海水體環(huán)境。以豆瓣企業(yè)為例，每年排放的廢水超過1.3億噸，而且傳統(tǒng)的豆瓣企業(yè)都是從家庭作坊式發(fā)展起來的，有廢水處理裝置的企業(yè)不多，因此在傳統(tǒng)企業(yè)向現(xiàn)代化企業(yè)轉(zhuǎn)型的過程中，豆瓣企業(yè)的廢水處理的環(huán)保處理裝置和技術(shù)也需要轉(zhuǎn)型。研究發(fā)現(xiàn)食品企業(yè)的廢水中有機物含量比較高，經(jīng)過物理、化學等方法多級處理后，剩下高濃度氨氮的廢水處理最經(jīng)濟有效的方法為微生物降解處理，其核心問題在于微生物菌種。因此，本文從豆瓣企業(yè)污水中篩選高效降解氨氮的土著微生物菌種，制作微生物菌劑，通過微生物強化技術(shù)解決豆瓣企業(yè)等食品企業(yè)的污水處理問題。

　　一、材料與方法

　　1.1 樣品

　　分別從鵑城、丹丹、揚名食品、清香園等四川省著名品牌的豆瓣生產(chǎn)企業(yè)采集生產(chǎn)污水，采用微生物實驗技術(shù)分離、篩選其中的土著微生物作為氨氮降解實驗研究的出發(fā)菌種。

　　1.2 實驗試劑

　　蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、六水合氯化亞鐵、氯化鈣、七水合硫酸鎂、琥珀酸鈉、酵母浸出物、硫酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、氧化鎂、溴百里酚藍、硼酸、甲基紅、甲基橙、亞甲藍、碳酸鈉，以上試劑均為分析純。

　　1.3 實驗儀器

　　三角瓶、燒杯、試管、容量瓶、平板、移液器槍頭、移液器、滅菌鍋、超凈工作臺、搖床、分光光度計、凱氏燒瓶、直形冷凝管、酸堿滴定臺、離心機、干燥箱、電磁爐、電子天平、真空冷凍干燥機

　　1.4 培養(yǎng)基

　　富集培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0，121℃滅菌20min。

　　分離培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂18-20g/L，pH7.0，121℃滅菌20min。

　　種子培養(yǎng)基：硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，六水合氯化亞鐵0.5g/L，氯化鈣0.2g/L，七水合硫酸鎂1g/L，琥珀酸鈉8.5g/L，121℃滅菌20min。

　　發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸銨3.9g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水合硫酸鎂1g/L，琥珀酸鈉2.8g/L，pH值6.5-7.5，121℃滅菌20min。

　　1.5 分離方法

　　1.5.1 微生物菌種的富集

　　按照5%的比例取混合均勻的水樣加入富集培養(yǎng)基中，28-30℃、180r/min搖床富集培養(yǎng)18-24h。

　　1.5.2 微生物菌種的分離、篩選

　　吸取上一步富集好的菌液，采用梯度稀釋的方法接種于分離平板上，28-30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，待單菌落長出，挑選形態(tài)差異的單菌落且在新的培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)挑單菌落和平板劃線的操作，直至單菌落為一種微生物，挑選單菌落接斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、保藏。

　　1.5.3 微生物菌種的保藏

　　對篩選到的菌種進行編號，制作真空冷凍干燥管保藏。

　　1.6 微生物發(fā)酵

　　種子培養(yǎng)基：挑選斜面培養(yǎng)的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，于28-30℃、180r/min條件下?lián)u床中震蕩培養(yǎng)18-24h，繪制其生長曲線。

　　發(fā)酵培養(yǎng)基：接種活化好的種子菌液，于搖床中震蕩培養(yǎng)。分別對菌種、接種量、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速(通氧量)等單因素條件進行優(yōu)化。挑選氨氮降解性能優(yōu)良的土著微生物菌種，按不同比例混合進行發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化發(fā)酵條件。

　　1.7 水質(zhì)指標檢測

　　測定氨氮的方法主要為納氏比色法和蒸餾―酸滴定法，本文采用蒸餾―酸滴定法測定微生物對氨氮的降解效果。

　　二、結(jié)果與分析

　　2.1 不同豆瓣企業(yè)生產(chǎn)污水的指標差異分析

　　從鵑城、丹丹、揚名食品、清香園等四川省著名品牌的豆瓣生產(chǎn)企業(yè)采集生產(chǎn)污水樣品，分別命名為JC、DD、YM、QXY。依次檢測4種水樣的pH值、氨氮濃度、TP濃度、COD值等指標，為模擬實驗環(huán)境下污水的水質(zhì)條件，進行微生物菌種的發(fā)酵實驗，以及對篩選的菌種進行馴化。從表1可以看出，豆瓣企業(yè)的生產(chǎn)污水的幾個主要污染指標分別為：pH值5-7，氨氮濃度0.1-1.0g/L，TP濃度0.1-1.0g/L，COD濃度3.0-10.0g/L。以此為依據(jù)，設(shè)計豆瓣土著微生物菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基為：硫酸銨3.9g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水合硫酸鎂1g/L，琥珀酸鈉2.8g/L，pH值6.5-7.5，121℃滅菌20min。

　　2.2 不同豆瓣企業(yè)生產(chǎn)污水中土著微生物的差異分析

　　選取進入中國地理標志品牌的郫縣豆瓣品牌企業(yè)作為研究對象，分別從郫縣鵑城豆瓣有限公司(鵑城)、四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司(丹丹)、成都揚名食品有限公司(揚名食品)和四川清香園調(diào)味品有限公司(清香園)收集生產(chǎn)污水水樣，包括污水處理池進水、曝氣池、厭氧池、出水等水樣各3份。采用傳統(tǒng)的梯度稀釋、平板分離的方法，共收集70多株微生物菌株。經(jīng)過光學形態(tài)鑒定和16SrDNA分子鑒定，如表2和圖1中結(jié)果，鵑城、丹丹、揚名食品、清香園生產(chǎn)污水中的微生物數(shù)量分別為15種、19種、17種和14種，其中芽孢桿菌屬占比最大。

　　2.3 土著微生物發(fā)酵降解氨氮實驗

　　根據(jù)發(fā)酵預(yù)實驗的結(jié)果，挑選了JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等共5株氨氮降解效果好的土著微生物菌種作為出發(fā)菌種，繪制其生長曲線，如圖2所示，5株土著微生物菌種的活化種子液濃度都是在10-15h之間達到最大值，以此活化土著微生物菌種，進行發(fā)酵實驗。

　　由表3可知，篩選的JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等5株土著微生物菌種發(fā)酵降解氨氮的效果比較顯著，預(yù)實驗條件下的氨氮降解率都在80%及以上，經(jīng)過16SrDNA分子生物學鑒定，分別為解鳥氨酸拉烏爾菌、纖維素菌屬、地衣芽孢桿菌、不動桿菌屬和假單胞菌屬。由圖3可知，土著微生物的降解氨氮效果大多數(shù)比較低，基本上都小于70%，離項目預(yù)期應(yīng)用的90%降解率還有一定距離，因此，對5種土著微生物菌種進行協(xié)調(diào)發(fā)酵，探索復(fù)合菌劑發(fā)酵對氨氮降解效果的影響。

　　2.4 復(fù)合微生物菌劑提高降解氨氮效果實驗初探

　　由表4和圖4可知由JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等5株土著微生物菌種按照1∶1∶1∶1∶1比例混合的復(fù)合微生物菌劑F1，其發(fā)酵降解氨氮的效果較之前的單一菌種發(fā)酵有顯著的提高，氨氮降解率達到93.75%，分別較單一菌種發(fā)酵降解氨氮的效率提高了8%、32%、65%、15%和24%。

　　三、結(jié)論

　　從豆瓣企業(yè)生產(chǎn)污水中分離、篩選的解鳥氨酸拉烏爾菌、纖維素菌屬、地衣芽孢桿菌、不動桿菌屬和假單胞菌屬等5株土著微生物菌株，編號分別為JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3，都具有顯著的氨氮降解效果，但離工業(yè)化污水處理菌劑還有差距，以該5株土著微生物菌種開發(fā)的復(fù)合微生物菌劑在氨氮降解效果上有明顯的改善，氨氮降解率達到93.75%，具有很好的應(yīng)用潛力。（來源：四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院）